Zdrowie / Odczynniki laboratoryjne
Instrukcja obsługi zestawu Attogene Universal 12s PCR Barcoding Kit
Przewodnik po zestawie Attogene Universal 12s PCR Barcoding Kit (NA2046). Dowiedz się, jak przygotować odczynniki, przeprowadzić analizę qPCR, zinterpretować wyniki i przechowywać zestaw.
Spis treści
Obrazy z instrukcji
Kliknij obraz, aby powiększyćNajważniejsze informacje
Zestaw Attogene Universal 12s PCR Barcoding Kit (nr kat. NA2046) jest przeznaczony do analizy ilościowej regionu genu 12s rRNA metodą qPCR w czasie rzeczywistym. Produkt służy wyłącznie do celów badawczych i nie może być stosowany w procedurach diagnostycznych.
Zasada działania
Zestaw wykorzystuje specyficzną mieszankę starterów (primerów) do amplifikacji regionu 12s rRNA. Detekcja odbywa się przy użyciu barwnika SYBR Green, który wiąże się z dwuniciowym DNA podczas amplifikacji PCR, umożliwiając monitorowanie fluorescencji w czasie rzeczywistym.
Wymagane wyposażenie i odczynniki (brak w zestawie)
- Instrument qPCR działający w czasie rzeczywistym
- qPCR 2X Master Mix z SYBR Green
- Zestaw do ekstrakcji DNA / próbki gDNA
- Probówki lub płytki do reakcji PCR
- Wirówka i wytrząsarka (vortex)
- Probówki PCR clean 1mL
- Mikropipety i końcówki
Przygotowanie odczynników
Master Mix: Wymagany jest Master Mix z 2x SYBR Green. Odczynnik jest wrażliwy na zanieczyszczenia, dlatego należy go obsługiwać w czystym obszarze, z dala od szablonu kontroli pozytywnej. Przechowywać w temperaturze -20°C, minimalizując cykle zamrażania i rozmrażania.
Mieszanka starterów (Primer Mixture): Również wrażliwa na zanieczyszczenia. Przechowywać w temperaturze -20°C w ciemności.
Kontrola jakości
- Negative Extraction Control (NEC): Przygotowywana przy każdej ekstrakcji DNA przy użyciu wody wolnej od RNaz/DNaz zamiast próbki. Służy jako kontrola zanieczyszczeń metody izolacji.
- No Template Control (NTC): Przygotowywana przez zastąpienie gDNA wodą wolną od RNaz/DNaz w reakcji PCR. Służy do sprawdzania zanieczyszczeń podczas przygotowywania płytki PCR.
Protokół qPCR
Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wykonać izolację gDNA. Dla optymalnych wyników zaleca się stężenie gDNA >10ng/uL przy stosunku czystości >1.80.
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej (na próbkę):
- 2X Master Mix 2X SYBR: 10uL
- Woda PCR: 8uL
- Zestaw starterów (Dual Primer set): 1uL
- Łączna objętość: 19uL
Po przygotowaniu mieszaniny, należy odpipetować 19uL do każdego dołka, a następnie dodać 1uL próbki gDNA (lub wody dla kontroli negatywnych).
Warunki amplifikacji
Cykl termiczny:
- Wstępna denaturacja (aktywacja Taq): 94°C przez 2 min (1 cykl)
- Denaturacja: 94°C przez 20 sek (35 cykli)
- Przyłączanie (Annealing): 52°C przez 30 sek (35 cykli)
- Wydłużanie (Extension): 74°C przez 45 sek (35 cykli)
Dane należy odczytywać podczas etapu wydłużania przez kanał SYBR.
Interpretacja wyników
Przed interpretacją należy zweryfikować integralność reakcji: NEC i NTC muszą być wolne od amplifikacji w kanale SYBR. Jeśli kryteria są spełnione, wyniki ocenia się na podstawie obecności sygnału dla celu i kontroli pozytywnej/negatywnej.
Przechowywanie
Zestaw należy przechowywać w temperaturze -20°C. Okres trwałości wynosi 12 miesięcy.
Praktyczna pomoc
Typowe problemy
Kontaminacja (NEC lub NTC wykazuje amplifikację)
Sprawdź czystość obszaru roboczego, używaj rękawiczek, unikaj zanieczyszczeń krzyżowych podczas pipetowania.
Wynik eksperymentu niejednoznaczny (CT > 35)
Zinterpretuj ponownie wynik na podstawie sygnału względnego celu względem kontroli negatywnej.
Eksperyment nieudany (kontaminacja)
Jeśli CT < 35 w kontroli negatywnej przy obecności kontroli pozytywnej, test należy powtórzyć.
Przed użyciem
- Sprawdź datę ważności zestawu.
- Upewnij się, że posiadasz Master Mix z 2x SYBR Green (brak w zestawie).
- Przygotuj czysty obszar roboczy, wolny od zanieczyszczeń DNA.
- Upewnij się, że stężenie gDNA wynosi >10ng/uL.
- Rozmroź odczynniki i delikatnie je wstrząśnij przed użyciem.
- Przygotuj odpowiednią liczbę reakcji, uwzględniając kontrole (NEC, NTC).
Ilustracje i schematy
- Tabela przygotowania mieszaniny reakcyjnej określa objętości Master Mix, wody i starterów.
- Tabela warunków amplifikacji określa temperatury i czasy dla poszczególnych etapów cyklu PCR.
- Tabela interpretacji wyników pomaga ocenić wynik na podstawie sygnałów kontroli pozytywnej i negatywnej.
Zgodność modelu
- Wymaga instrumentu qPCR obsługującego detekcję SYBR Green.
- Wymaga zewnętrznego Master Mix z 2x SYBR Green.
- Przeznaczony wyłącznie do celów badawczych (Research Use Only).
Autor opracowania
Marek Zieliński
Redaktor instrukcji technicznych
Specjalizuje się w dokumentacji urządzeń domowych, elektroniki i narzędzi. Dba o jasny opis najważniejszych funkcji oraz praktyczne wskazówki dla użytkownika.