Instrukcja obsługi systemu GoTaq Probe 1-Step RT-qPCR

Najważniejsze informacje z instrukcji

System GoTaq Probe 1-Step RT-qPCR jest zoptymalizowany do testów ilościowych PCR w formacie sondy hydrolizującej. Umożliwia wykrywanie i relatywną kwantyfikację poziomów ekspresji RNA w jednej reakcji. System wykorzystuje technologię hot-start, co pozwala na przygotowanie reakcji w temperaturze pokojowej.

Przechowywanie i komponenty

Wszystkie komponenty systemu należy przechowywać w temperaturze od -30°C do -10°C i chronić przed światłem. W przypadku krótkotrwałego przechowywania i częstego użycia, mieszaninę GoTaq Probe qPCR Master Mix można przechowywać w temperaturze od +2°C do +10°C przez okres do 3 miesięcy, pod warunkiem ochrony przed światłem. Przed użyciem należy rozmrozić odczynniki (nie w podwyższonej temperaturze) i wymieszać je delikatnie (vortex 3-5 sekund).

Zapobieganie kontaminacji

Aby zminimalizować ryzyko kontaminacji, zaleca się:

• Stosowanie wyznaczonych stref pracy oraz pipet dedykowanych do etapów przed i po amplifikacji.
• Regularną zmianę rękawiczek.
• Stosowanie końcówek do pipet z filtrem (aerosol-resistant).
• Niezdejmowanie wieczek z płytek reakcyjnych po zakończeniu amplifikacji.

Protokół przygotowania mieszaniny reakcyjnej

Końcowa objętość reakcji wynosi 20µl. Procedura przygotowania:

1. Rozmroź GoTaq Probe qPCR Master Mix i wodę wolną od nukleaz.
2. Wymieszaj odczynniki za pomocą vortexu.
3. Przygotuj mieszaninę reakcyjną (bez matrycy RNA), łącząc: GoTaq Probe qPCR Master Mix (10µl), GoScript RT Mix (0,4µl), startery (1µl każdy), sondę (1µl) oraz wodę (dopełnienie do 20µl).
4. Dodaj odpowiednią objętość mieszaniny do probówek lub płytek PCR.
5. Dodaj matrycę RNA (2-5µl).
6. Uszczelnij płytkę i odwirować krótko przed umieszczeniem w instrumencie.

Warunki cykli termicznych

System obsługuje dwa tryby pracy:

• Standardowy: Odwrotna transkrypcja (45°C, 15 min), Inaktywacja RT/Aktywacja polimerazy (95°C, 2 min), Denaturacja (95°C, 15 s), Wyżarzanie i elongacja (60°C, 1 min) - 40 cykli.
• FAST: Odwrotna transkrypcja (45°C, 5 min), Inaktywacja RT/Aktywacja polimerazy (95°C, 2 min), Denaturacja (95°C, 3 s), Wyżarzanie i elongacja (60°C, 30 s) - 40 cykli.