Instrukcja obsługi zestawu ELISA Biomean Human MMP-13 (FK-1277)

Najważniejsze informacje z instrukcji

Zestaw ELISA Biomean Human MMP-13 (FK-1277) służy do oznaczania stężenia ludzkiej metaloproteinazy macierzy 13 (MMP-13) w surowicy, osoczu, nadsączach hodowli komórkowych i innych próbkach. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do badań naukowych (in vitro research use only), nie do celów diagnostyki klinicznej.

Zasada działania testu

Test wykorzystuje metodę kanapkową (sandwich ELISA). Na mikropłytce pokrytej przeciwciałem anty-MMP-13 osadza się kalibrator lub próbkę, a następnie dodaje przeciwciało znakowane biotyną. Po inkubacji i przemyciu dodaje się awidynę sprzężoną z HRP. Po kolejnej inkubacji i przemyciu dodaje się roztwór chromogenny TMB, który zmienia kolor na niebieski, a po dodaniu roztworu zatrzymującego na żółty. Absorbancję mierzy się przy długości fali 450 nm.

Skład zestawu i przechowywanie

• Przechowywać w temperaturze 2-8°C.
• Nie używać przeterminowanych zestawów.
• W skład zestawu wchodzą m.in.: płytka z mikropłytkami, standardy, roztwór do rekonstytucji, rozcieńczalnik, przeciwciało biotynowe, koniugat HRP, substrat TMB, roztwór zatrzymujący i roztwór myjący.
• Przed użyciem sprawdzić, czy etykiety i ilości odczynników są zgodne z tabelą w instrukcji.

Przygotowanie próbek

• Surowica: Pozwolić na krzepnięcie w temperaturze pokojowej przez 30 minut, odwirować (2000 x g, 20 min), zebrać surowicę.
• Osocze: Użyć antykoagulantów (heparyna, cytrynian, EDTA). Odwirować (2000 x g, 20 min), w razie potrzeby powtórzyć wirowanie (10000 x g, 10 min) w celu usunięcia płytek.
• Nadsącz hodowli komórkowej: Odwirować w celu usunięcia osadów.
• Lizat komórkowy: Przemyć komórki PBS, dodać bufor lizujący, odwirować (10000-14000 x g, 3-5 min) i zebrać nadsącz.
• Próbki należy analizować natychmiast lub zamrozić w -20°C, unikając wielokrotnego rozmrażania.

Procedura testowa

1. Doprowadzić wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej (20-25°C).
2. Przygotować roztwory robocze.
3. Dodać 50 μL standardów/próbek do odpowiednich studzienek. Dodać 50 μL rozcieńczalnika do studzienek z rozcieńczalnikiem. Pozostawić studzienki ślepe (blank) puste.
4. Dodać 100 μL przeciwciała znakowanego biotyną do wszystkich studzienek (oprócz blank). Inkubować 60 minut w 37°C.
5. Przemyć płytkę 5 razy roztworem myjącym.
6. Dodać 100 μL streptawidyny sprzężonej z HRP do wszystkich studzienek (oprócz blank). Inkubować 20 minut w 37°C.
7. Przemyć płytkę 5 razy.
8. Dodać 100 μL substratu TMB. Inkubować 15 minut w 37°C.
9. Dodać 50 μL roztworu zatrzymującego.
10. Odczytać absorbancję przy 450 nm.

Obliczanie wyników

Wykreślić krzywą standardową (stężenie na osi X, absorbancja na osi Y). Użyć oprogramowania do dopasowania krzywej (model 4-PL). Jeśli próbki były rozcieńczane, pomnożyć wynik przez współczynnik rozcieńczenia.